ブックタイトル日本結晶学会誌Vol57No2

概要

日本結晶学会誌Vol57No2

西増弘志(a)HNHdomainRuvCdomainREC2domainREC1domain(b)HNH domainREC2domainREC1domainPI domainRuvC domainPAMPI domain(c)GGGGTTArg1335Arg1335Arg1333Arg1333図8Cas9単体とCas9-sgRNA-2本鎖DNA四者複合体の結晶構造．（CrystalstructuresofapoCas9andtheCas9-sgRNAtargetDNAquaternarycomplex.）（a）Cas9単体の結晶構造（PDBID4CMP）．（b）Cas9-sgRNA-2本鎖DNA四者複合体の結晶構造（PDB ID 4UN3）．（c）PAM認識機構（ステレオ図）．を得て，約8 A分解能のX線回折像を得ることに成功した．しかし，Doudna研のポスドク時代にCas9の生化学5的機能）23と結晶構造）を筆頭著者として発表したのち，スイスで独立したMartin Jinekのグループにより先を越されてしまった．24）Jinekらの決定したS. pyogenes Cas9-sgRNA-2本鎖DNA四者複合体は，筆者らの決定したS. pyogenes Cas9-sgRNA-相補鎖DNA三者複合体と同様の全体構造をとっていた（図8b）．筆者らの結果と一致して，四者複合体においてPAMはPIドメインによって認識されていることが明らかになった24）（図8c）．NGGPAMの2つのグアニン塩基は，PIドメインの2つのアルギニン残基（Arg1333とArg1335）と塩基特異的な水素結合を形成していた．2014年5月にベルリンで開かれた国際会議においてJinekと話す機会があった．彼らはCas923単体構造の論文）を発表した2月の第1週に四者複合体の構造決定に成功しており，その一週間後に発表され19た筆者らの三者複合体の結晶構造）を見て非常に驚いたとのことだった．Cas9の研究競争は想像以上の厳しさだった．11．Cas9を応用した転写活性化システム最近，筆者らは構造情報に基づきCas9を改変し，新規の転写活性化ツールを開発した．25）Cas9-sgRNA-標的DNA三者複合体においてステムループ1，3の先端はCas9と相互作用している一方，テトラループとステムループ2は溶媒側に露出していることに着目し，MS2タンパク質と結合するRNAアプタマーをテトラループとステムループ2に融合した改変型sgRNAを作製した（図9）．この改変型sgRNA，転写活性化因子VP64を融合したdCas9，および，転写活性化因子p65とHSF1を融合したMS2タンパク質を細胞に共発現させることにより，高い効率で標的遺伝子を活性化させることに成功した（図9）．この転写活性化システムをSAM（synergisticactivation mediator）と名づけた．さらに，すべてのヒト遺伝子（23,430種のアイソフォーム）を標的とするsgRNAライブラリーを合成し，活性化すると抗がん剤耐性につ102日本結晶学会誌第57巻第2号（2015）