ブックタイトル日本結晶学会誌Vol57No2

概要

日本結晶学会誌Vol57No2

西増弘志と離れた位置に存在していたことから，今回決定した構造は不活性型であることが示唆された．RECローブとNUCローブはブリッジヘリックスとディスオーダーしたリンカー領域によって連結されていた．sgRNAと相補鎖DNAからなるRNA-DNAヘテロ2本鎖は2つのローブのあいだに収容されていた（図4）．sgRNAはcrRNA配列とtracrRNA配列，および，それらをつなぐテトラループから構成される（図2c）．crRNA配列はガイド配列（20塩基）とリピート配列（12塩基）からなり，tracrRNA配列はアンチリピート配列（14塩基）と3＇テイル配列からなる（図5）．結晶構造から，sgRNAはT字型構造をとり，Cas9と結合していることが明らかになった（図5）．ガイド配列と相補鎖DNAは20対のWatson-Crick塩基対を介してガイドRNA：標的DNAヘテロ2本鎖を形成し，リピート配列とアンチリピート配列は9対のWatson-Crick塩基対を介してリピート：アンチリピート2本鎖を形成していた．リピート：アンチリピート2本鎖に含まれる6つの塩基は塩基対を形成せず，その結果，リピート：アンチリピート2本鎖は不完全な2本鎖構造をとっていた．3＇テイル配列は3つのステムループ（ステムループ1～3）を形成し，ステムループ1とステムループ2はリンカー領域によって連結されていた．7．RECローブRECローブはαヘリックスから構成される新規なフォールドをとっていた（図6）．ガイドRNA：標的DNAヘテロ2本鎖はおもにREC1ドメインにより塩基配列非依存的に認識されていた（図6）．この構造的な特徴は，Cas9は任意のガイド配列をもつsgRNAと結合し，ガイド配列依存的に標的DNAを認識することと一致していた．リピート：アンチリピート2本鎖はREC1ドメインにより塩基配列依存的に認識されていた（図6）．この構造的な特徴は，Cas9オルソログはアミノ酸配列の異なるRECローブをもち，塩基配列の異なるリピート：アンチリピート2本鎖を認識することと一致していた．一方，REC2ドメインはRNA，DNAと相互作用していなかった．変異体解析の結果，REC1ドメインはDNA切断活性に必須である一方，REC2ドメインは活性に必須ではないことが明らかになった．ステムループ1はRECローブとNUCローブにより認識されており，ステムループ2，3はNUCローブと相互作用していた（図4）．ステムループ2，3はin vivoにおけるDNA切断活性に重要である．20）したがって，ステムループ2，3とCas9のあいだの相互作用はin vivoにおける複合体形成に重要であると考えられた．8．NUCローブRuvCドメインはRNase Hフォールドをもち，活性残基（Asp10，Glu762，His983，Asp986）はRuvCなどほかのRNase Hスーパーファミリーのヌクレアーゼと同様の配置をとっていた（図7a）．したがって，Cas9のRuvCドメインはRNase Hスーパーファミリーに属する既知のヌクレアーゼと同様の反応機構により非相補鎖DNAを切断することが示唆された．一方，HNHドメインはββα-TargetTargetGuideBridge helixREC2domainGuideBridge helixREC2domainStemloop 1Stemloop 1RepeatREC1domainRepeatREC1domainAnti-repeatAnti-repeatTetraloopTetraloop図6 RECローブによるsgRNA-標的DNA認識（ステレオ図）．（Recognition of the sgRNA-target DNA by the REC lobe.）100日本結晶学会誌第57巻第2号（2015）