ブックタイトル日本結晶学会誌Vol56No6

概要

日本結晶学会誌Vol56No6

ヘム鉄代謝の鍵となる電子伝達複合体の構造解析図3?TGEE-ヘム-HO-1複合体のX線小角散乱による解析.（SAXS analysis of ?TGEE-heme-HO-1 complex.）（a）X線散乱プロファイル.実線は実測値,点線は結晶構造からの予測値.（b）DAMMINによって作製した粗視化モデルと結晶構造の重ねあわせ.（文献7)より転載）ら, HO-1のLys 149, Lys 153, Arg 185がCPRとの相互作用に関与することを明らかにしていたが,それらの残基は?TGEEとの相互作用界面に存在した.細胞内でCPRはN末端側, HO-1はC末端側で小胞体膜に結合している.われわれはラットCPRとラットHO-1を可溶化して取り扱いやすくするために, CPRではN末端57残基, HO-1ではC末端側22残基を切除した組み換え酵素を結晶化や生化学実験に用いている15),16)が,複合体中で?TGEEのN末端側とHO-1のC末端側は同じ方向にあり,小胞体膜の位置を考慮しても,この複合体構造は無理のないものであった（図2）.さらに?TGEE-ヘム-HO-1複合体のX線小角散乱データ（q＝0.035～0.2 A ?1）は,結晶構造からCRYSOL 17)によって計算した値と一致し, DAMMIN 18)によってX線小角散乱データから得られた?TGEE-ヘム-HO-1複合体の粗視化モデルも結晶構造とほぼ一致した（図3）.このように, ?TGEE-ヘム-HO-1複合体の結晶構造は,溶液構造と矛盾のないものであり,分子パッキングによる影響はほとんどないと考えられる.しかし,結晶化に用いたのは変異CPRであり,野生型CPRも同様の相互作用様式かどうかはわからないので,さらに確証を得るために, ?TGEEとヘム-HO-1の相互作用界面に存在し,お互いにそれぞれ近傍に位置するThr 88（CPR）とVal 146（HO）, Gln 517（CPR）とLys 177（HO）をシステインに置換し, CPR-HO間でジスルフィド結合が形成されるかどうかをSDS-PAGEにより確認した.ここで用いたシステイン置換CPRはヒンジ領域を野生型と同じ配列に戻している.還元剤を含まないSDS-PAGEの結果, T88C CPRとV146C HO-1, Q517C CPRとK177C HO-1でCPR-HO間のジスルフィド結合が形成されることが日本結晶学会誌第56巻第6号（2014）確認され,野生型CPRも?TGEEと同様の結合様式であることが確認された（図4）.?TGEE-ヘム-HO-1複合体の結晶構造は,野生型CPR-ヘム-HO-1複合体の構造情報をよく反映していることがわかったので, CPRとHOの相互作用様式について考察する. HO-1のヘム結合ポケット周辺は正に帯電していたため, CPRの負に帯電した領域と相互作用するであろうことは予想されていた.実際に複合体の静電ポテンシャルを見ると, CPRのFMN結合部位周辺の負に帯電した領域とHO-1のヘム結合ポケット周辺は相互作用していた.それに加えて, CPRのFAD結合ドメインの正に帯電している領域と, HO-1のG-helixおよびC-helixとD-helixの間のループ（CDループ）の負に帯電している領域が相互作用していた（図5）.このように, CPRのFAD結合ドメインとFMN結合ドメインがHO-1を挟みこむように結合していた. ?TGEEや野生型CPRはヘム-HO-1複合体には結合するが,ヘムを結合していないアポHO-1には結合しない.アポHO-1はCPRから電子を受け取れないので,このことは無駄な相互作用を減らすという意味で重要である.その構造的要因の1つは,アポHO-1でのヘムポケット周辺,特に遠位側ヘリックスの構造変化である. 19)ヘムポケット周辺はCPRとの相互作用部位なので,その変化がFMN結合ドメインとの相互作用を弱める方向に働くと考えられる.もう1つの要因はHO-1の構造揺らぎの変化と考えている.われわれはNMRによる緩和速度（R 2分散）の解析から,アポHO-1ではヘムポケット周辺とCDループに構造揺らぎが見られ, Zn-プロトポルフィリンIX（ヘムの類似化合物であり, HO-1の競合阻害剤）の結合により,その揺らぎが停止することを観測している. 20) CDループは395