日本結晶学会誌Vol55No3 page 31/82

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日本結晶学会誌Vol55No3

日本結晶学会誌55，197-202（2013）最近の研究からヒトMAPキナーゼJNK1の立体構造・機能・安定性に対する遊離システイン残基の置換効果大阪大学蛋白質研究所仲庭哲津子大阪府立大学大学院生命環境科学研究科深田はるみ日本原子力研究開発機構量子ビーム応用研究部門黒木良太大阪府立大学大学院理学系研究科木下誉富Tetsuko NAKANIWA, Harumi FUKADA, Ryota KUROKI and Takayoshi KINOSHITA:Seven Cysteine-Deficient Mutants Depict Interplay between Thermal and ChemicalStabilities of Individual Cysteine Residues in MAP Kinase JNK1To characterize the role of cysteine residues on the structure, function and stability of JNK1,we prepared and evaluated the wild-type JNK1 and seven cysteine-deficient JNK1 proteins.The solvent exposed cysteine residues did not influence biological function and mutating theseresidues raised the thermal stability because of newly formed hydrogen bonds and of higherhydration as speculated by the mutant structures. The surface cysteine involved in the molecularsurfacehydrophobic pocket did not affect biological function; although a moderate thermaldestabilization was observed. Cysteines in the loosely-assembled hydrophobic environmentmoderately contributed to thermal stability and the mutations of these cysteines had negligibleeffect on enzyme activity. The other cysteines are involved in the tightly-filled hydrophobiccore and mutation of these residues conferred the adverse effects on the thermal stability andenzyme activity.1．はじめに細胞質タンパク質中に存在する遊離システイン残基は,生物学的な機能や構造形成,安定性に寄与している.例えば,酵素におけるシステイン残基は活性中心として作用するのに対して, 1),2)調節タンパク質に存在するシステイン残基はS-ニトロシル化やS-グルタチオン化のような化学修飾を伴った分子スイッチとして作用する. 3),4)このような機能はシステイン残基に含まれるSH基の求核反応性によるものであるが,システイン残基のもつ疎水的な性質が,疎水性クラスターの形成によってコンフォメーションの安定化に寄与していることも重要な側面である.これらのシステイン残基は,一般の実験環境では酸化によるタンパク質の化学的な不安定性を生じる原因となるため厳密な還元環境の構築が必須であるが,遊離型のシステイン残基を化学的に安定なアミノ酸に置換することができれば構造生物学研究にも大きなメリットが生じるはずである.JNK1（c-Jun N-terminal kinase 1）はアポトーシスや炎症性サイトカインの産生などに関与する,ストレス応答性MAPキナーゼであり,免疫炎症性疾患などの創薬標的である. JNK1は7つの遊離システイン残基を有しており,好気的環境において分子間または分子内部の非特異的S-S日本結晶学会誌第55巻第3号（2013）結合形成から誘導される酸化的凝集を起こしやすい.この性質は結晶構造解析などの物理化学的な実験を行う上で大きな障害となる.このようなJNK1分子の性状を改善するアプローチとして,遊離システイン残基を異なるアミノ酸に置換することが有効であると考えられる.例えば, MAPキナーゼp38αの研究では, 1つの分子表面システイン残基のセリンへの変異が凝集抑制に働き,その結果,結晶成長能が改良された. 5)また, JNK2においても分子表面上のC117SおよびC222Sの2重変異によって,野生型に比べて溶解性が改善された. 6)このような化学的不安定性はすべてのシステイン残基に当てはまるのであろうか？そこでJNK1を用いて下記の2つの課題について検討した.（i）すべての表面システイン残基は,前述のような表面システイン残基と同様のふるまいをするのか？（ii）分子内部に埋もれたシステイン残基は,生体機能,安定性,構造形成にどのくらい貢献しているのか？野生型JNK1の7つの遊離システイン残基は,構造環境という視点から分子表面3カ所（C116, C163, C245）と分子内部4カ所（C41, C79, C137, C213）と大別される（図1,表1）.本研究では,これらシステイン残基の役割を調べるために, JNK1の野生型および7カ所のシステイン残基をそれぞれ化学的に安定なアミノ酸に置換した変197